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前言

近十年来，冷冻电镜单颗粒分析技术已成为解析结构的重要方法之一。单颗粒冷冻电镜与X射线晶体衍射学、核磁共振相互补充，为理解生物学界的生理病理过程提供了重要的基础依据。随着技术的进步，冷冻电镜方法逐渐成为蛋白原子分辨率结构解析的常规方法。

虽然冷冻电镜的技术革新带领我们进入到了原子分辨率时代，但是对于小蛋白应用冷冻电镜的普适性仍受限，也存在更高的技术门槛。目前，基于冷冻电镜的小蛋白高分辨率结构解析主要存在两个问题：

1. 由于小蛋白粒径相对于冰层的厚度较小，导致获得的信噪比较低，从而影响了结构的分辨率

2. 小蛋白的形态特征并不明显，更难解析高分辨结构

为了解决这些问题，也为了更好的探究与小蛋白相关的科学问题，科学家们发展出了多个方法来帮助小蛋白的结构解析。其中，增加小蛋白的蛋白质分子量，成为一个重要的应用方向，特别是使用Nanobody-based Assemblies，Fusion Tags和Symmetric Scaffolds等方法来帮助小蛋白高分辨结构解析。

02

GPCR策略

作为跨膜蛋白的最大家族，G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors, GPCRs）识别的信号分子种类繁多，如离子、多肽和脂类等，这类受体介导的信号通路与诸多生命活动和病理现象密切相关。据统计，30-40%上市药靶向GPCRs。毋庸置疑，GPCR家族的三维结构信息极大地促进了对GPCRs生物学功能的认识和靶向GPCR的药物研发。

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与传统的晶体学手段相比，冷冻电镜技术（cryo-EM）在解析生物大分子高分辨率结构方面具有明显优势，例如无须获得晶体、所需样品量小和样品制备方式多样等，且已被广泛应用于解析激活GPCR与下游蛋白的复合物结构。

然而，约85% GPCRs的大部分区域包埋在脂膜环境中，这导致非激活GPCRs在未结合下游蛋白时其冷冻电镜数据处理仍具有十分重大的挑战。因此，通过生化手段引入辅助性工具蛋白将极大地促进冷冻电镜技术在解析GPCRs非激活状态上的应用，从而加深对GPCRs不同生理状态和生物学功能的理解。为融合蛋白策略和cryo-EM技术相结合的技术路线在GPCRs（甚至是其他小型膜蛋白）结构解析中的有效应用提供了思路。